Le risque prion en laboratoire

La protéine prion, l'agent probable des encéphalopathies spongiformes transmissibles, à cause de sa résistance et de la connaissance encore incomplète de son infectiosité, pose des problèmes particuliers en matière d'hygiène et sécurité en laboratoire.

La protection des personnels nécessite donc des recommandations spécifiques. Celles-ci pourront être modifiées en fonction de nouveaux résultats scientifiques. Les pièces anatomiques sont des organes, membres, fragments de corps, aisément identifiables par non spécialiste (une tête de souris par exemple). Le cadavre est évidemment la pièce anatomique suprême...

Le déchet opératoire c'est ce que le même non spécialiste ne pourra pas identifier.

Glossaire

EST : Encéphalopathie spongiforme transmissible

PrPc : Forme cellulaire (non pathologique) de la protéine prion

PrPSc : Forme scrapie (pathologique) de la protéine prion ; considérée comme l'agent de transmission des EST

Gène PRNP : Gène de la protéine prion

Agent identifié de la tremblante du mouton ou des EST de rongeurs (souris, hamster) : ce sont les souches stabilisées qui ont été bien caractérisées (tableau clinique, profil immunoélectrophorétique d'une dégradation par la protéinase K, preuve qu'il ne s'agit pas de la forme bovine)

nvMCJ : nouveau variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob

Les voies de contamination

L'épidémiologie et l'expérimentation n'ont jamais rapporté une contamination à travers une peau saine, ni par voie respiratoire, mais ont mis en évidence diverses autres voies de contamination.

De toutes ces voies, ne subsistent, de façon plausible dans un travail de laboratoire, que :

  • la voie intramusculaire ou sous-cutanée après blessure par un outil coupant ou piquant souillé par une préparation de PrPSc ou une fraction d'échantillon biologique très infectieux
  • la voie oculaire par projection dans l'œil de préparation de PrPSc ou d'une fraction d'échantillon biologique très infectieux
  • éventuellement la voie digestive lors de la manipulation de préparation concentrée de PrPSc ou d'échantillon biologique très infectieux

Les organismes à risque

On appellera "organismes à risque important" :

  • les animaux atteints d'une EST ou engagés dans une contamination expérimentale par PrPSc
  • les patients atteints par une EST ainsi que leur famille (ascendants, descendants ou collatéraux)
  • les personnes qui ont des antécédents d'intervention neurochirurgicale, d'exploration cérébrale invasive, de greffe de cornée ou de dure-mère (sauf si les soins ont été donnés en France et depuis 1995) ou de traitement par une hormone hypophysaire extractive.
On appellera "organismes à risque faible", tous les autres organismes.

ATTENTION ! il faut bien comprendre que le risque n'est jamais nul : d'une part, l'incubation des EST est souvent longue et les symptômes très tardifs ; d'autre part la découverte des nvMCJ (liés probablement à la consommation de produits alimentaires contaminés d'origine bovine) élargit considérablement, et de façon non ciblée, la population des malades possibles.

Les tissus infectieux

On considérera comme "tissus très infectieux" :

  • le système nerveux central (cerveau, cervelet, tronc cérébral, moelle épinière, y compris l'hypophyse, la dure-mère, l'oreille interne et le LCR) ;
  • l'œil et le nerf optique ; 
  • les formations lymphoïdes organisées (rate, ganglions lymphatiques, amygdales, appendice, plaques de Peyer et formations équivalentes du gros intestin, du rectum et du carrefour aérodigestif). 

On considérera comme "tissus peu ou pas infectieux" tous les autres tissus. 

ATTENTION !

  • On admet que dans les formes classiques d'EST humaines l'infectiosité des formations lymphoïdes est très faible ; il en va autrement des nvMCJ pour lesquels l'infectiosité de ces tissus est bien présente, y compris pendant la phase préclinique.
  • A la suite d'observations faites sur l'animal, l'OMS classe également comme tissus faiblement infectieux les reins, le foie, les poumons et le placenta. Chez l'homme, l'OMS ne préconise de tenir compte de cette infectiosité que chez les malades déclarés ou suspectés.
  • L'infectiosité du sang chez les nvMJC est confirmée mais la probabilité de contamination par le sang au laboratoire paraît très faible, si même elle existe.

Quel niveau de confinement ?

Il faudra manipuler : 

en niveau 3 (L3 - Laboratoire confiné - et/ou A3 - Animalerie confinée) : 

  • les préparations concentrées de PrPSc d'un agent identifié de la tremblante de mouton ou des EST de rongeurs ;
  • les préparations de toutes les autres PrPSc ;
  • les PrP recombinantes humaine et bovine ainsi que les peptides qui en sont issus sauf si leur absence de pathogénicité a été démontrée ;
  • les préparations de tout les PrP recombinantes humaine et bovine ainsi que les peptides qui en sont issus sauf si leur absence de pathogénicité a été démontrée ;
  • les OGM contenant tout ou partie d'un gène PRNP (sauf avis différent du HCB : l'agrément préalable doit obligatoirement être demandé) ;
  • les échantillons biologiques (animaux, tissus, cellules) infectés par un agent d'EST autre qu'un agent identifié de la tremblante de mouton ou des EST de rongeurs ;
  • les tissus très infectieux (hors formations lymphoïdes) des organismes humains à risque important ;

les formations lymphoïdes humaines d'origine britannique ou si le tableau clinique évoque un nvMCJ ou une maladie neurodégénérative au sens large.

en niveau 2 (L2 et/ou A2) :

  • agent identifié de la tremblante de mouton ou des EST de rongeurs : les préparations de PrPSc à faible concentration et les échantillons biologiques infectés ;
  • les PrP recombinantes de moutons ou rongeurs, ainsi que les peptides qui en sont issus sauf si leur absence de pathogénicité a été démontrée ;
  • les banques génomiques, en système procaryote et sans expression, obtenues à partir de tissus sains et non génétiquement modifiés ; il est absolument nécessaire qu'une analyse de risque soit réalisée par le HCB lors de la demande d'agrément.
  • les tissus très infectieux des organismes humains à faible risque pour lesquels la présence de PrPsc a été recherchée et n'a pu être mise en évidence par les méthodes les plus appropriées du moment ;
  • les formations lymphoïdes humaines (hors provenance britannique) si le tableau clinique n'évoque pas un nvMCJ ou une maladie neurodégénérative au sens large *.

* Ce niveau de confinement pourrait être revu à la hausse si le nombre de nvMCJ augmentait notablement en France (à la date du 15 octobre 2010 : 24 cas certains ou probables ; pour actualiser ce chiffre :

en niveau 1 (L1 et/ou A1) :

  • la protéine PrPC ;
  • les peptides de PrP recombinante à la condition que leur absence de pathogénicité ait été démontrée ;
  • les préparations de PrPSc ou des échantillons infectés (notamment coupes de microscopie) s'ils ont été inactivés à l'acide formique ;
  • les animaux injectés avec de la PrPSc inactivée à l'acide formique (obtention d'anticorps par exemple).

Les consignes de protection

Le travail dans un L2 ou un L3 impose des règles d'organisation et une gestuelle particulières.

Une expérimentation sur le prion doit donc respecter ces exigences selon le niveau de confinement requis. Contactez votre Ingénieur hygiène et sécurité si vous ne connaissez pas ces exigences.

Ces règles sont complétées par quelques consignes destinées à faire obstacle aux voies de contamination possibles lors d'un travail à risque prion.

Les manipulations de prélèvements très infectieux, de cultures d'OGM d'expression du prion ou de préparations de PrPSc se feront :

  • en portant des lunettes de protection à coques latérales 
  • avec des gants latex
  • et, autant que possible, en proscrivant l'usage de matériel piquant ou coupant.

Autopsie et travaux d'anatomopathologie

Pour toutes les autopsies, ainsi que pour l'anatomopathologie sur des organes à risque, il faudra utiliser : 

  • une scie à main ou une scie électrique protégée (pour éviter les projections) ;
  • un gant renforcé (fils métalliques) entre deux gants latex ;
  • un masque antiprojection couvrant tout le visage ;
  • un tablier à usage unique sur la tenue habituelle ;
  • une couteau de microtome jetable.

Enfin, les coupes de microscopies (fixées, même par le formol, ou à fixer) seront inactivées par un traitement à l'acide formique pur pendant une heure à 20 °C (Brown, Wolff et Gajdusek. A simple and effective method for inactivating virus infectivity in formalin-fixed tissue samples from patients with Creutzfeldt-jakob disease. Neurology 1990; 40:887-890).


La décontamination du matériel souillé

Pour la décontamination du matériel souillé (par exemple matériel de dissection), il est recommandé de faire au préalable un nettoyage avec un détergent sans aldéhyde, puis de rincer à l'eau.

L'utilisation de matériel unique doit être la règle. Lorsque ce n'est pas possible, le matériel réutilisable devra subir une inactivation particulière.

Le prion est résistant à de nombreuses méthodes habituelles d'inactivation ; l'action de l'éthanol ou des aldéhydes (dont le formaldéhyde) le protège même de méthodes ultérieures d'inactivation.

Un protocole validé a été diffusé par l'OMS ; il comporte une succession ordonnée de deux ou trois étapes selon la situation de risque :

1- une première étape de nettoyage dans un bain de détergent sans aldéhyde pendant au moins 15 minutes ; il est important de ne pas laisser sécher le matériel souillé.

2- un bain dans la soude 1N, 1 heure à 20 °C, ou dans l'eau de Javel 2% de chlore actif pendant 1 heure à 20 °C.

3- enfin, un autoclavage à 134°C pendant 20 minutes. Le niveau de risque de la situation est apprécié par la combinaison de deux critères : les organismes et les tissus manipulés.

Le schéma d'inactivation découle alors du tableau suivant :

ORGANISMES À RISQUE IMPORTANT

ORGANISMES À RISQUE FAIBLE

TISSUS TRÈS INFECTIEUX

 1- détergent
 2- soude ou javel
 3- autoclavage à 134°

 1- détergent
 2- soude, javel ou autoclavage à 134°

TISSUS PEU OU PAS INFECTIEUX

 1- détergent
 2- soude, javel ou autoclavage à 134°

 conditions classiques :
 autoclavage à 121°C ou javel à 0,36% de chlore actif



L'élimination des déchets

Déchets solides contenant ou souillé par tout les tissus très infectieux quel que soit l'organisme , ou tout tissu d'un organismes à risque important :

Ils sont collectés, inactivés par un autoclavage de 20 minutes à 134 °C et éliminés par incinération comme déchets d'activités de soin à risque infectieux (DASRI).

Leur destruction par incinération au delà de 800°C est attestée par un bordereau de suivi à exiger auprès du prestataire de service.

Si, notamment sur des sites hospitaliers, il existe un système agréé de prétraitement des DASRI (Ecostéryl, Occigerm, Sthemos, Virhoplan...), il sera obligatoire de collecter à part les déchets à risque prion et de les identifier afin de ne pas les mélanger avec les autres DASRI car le seul mode admis de leur destruction est l'incinération.

Déchets liquides :

Avant évacuation, les déchets liquides issus de manipulations sur des tissus très infectieux ou sur des organismes à risque important , seront inactivés par autoclavage à 134°C pendant 20 minutes.



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